ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ФАКТОР МОЛОДОСТИ

ГОМЕОБОКСНЫЙ ФАКТОР ТРАНСКРИПЦИИ NANOG FLJ12581

Цитогенетическое местоположение: 12p13.31.

Геномные координаты (GRCh38): 12:7,789,402-7,799,146.

Плюрипотентность - это свойство клеток дифференцироваться в производные всех трех первичных зародышевых листков: эктодермы, энтодермы и мезодермы, а также образовывать во время эмбрионального развития клетки-предшественники функциональных гамет. Плюрипотентными являются клетки внутренней клеточной массы (ВКМ) и эпи-бласта предымплантационных эмбрионов млекопитающих. В онтогенезе из плюрипотентных клеток формируется взрослый организм.

Эмбриональные стволовые клетки (ES), полученные из внутренней клеточной массы (ICM) бластоцист, растут бесконечно, сохраняя плюрипотентность. Lif (159540) может поддерживать самообновление ES-клеток мыши посредством активации Stat3 (102582), но не требуется для поддержания ICM и человеческих ES-клеток. В поисках критического фактора (факторов), лежащего в основе плюрипотентности как ICM, так и ES-клеток, Mitsui et al. (2003) провели дифференциальный анализ in silico и идентифицировали несколько генов, специфически экспрессируемых в ES-клетках мыши и предимплантационных эмбрионах. Один из них, кодирующий гомеопротеин, который авторы назвали Nanog (от "Тир На Ног", мифологической кельтской страны вечно молодых), был способен поддерживать самообновление клеток ES независимо от Lif/Stat3. кДНК мыши Nanog содержит открытую рамку считывания, кодирующую полипептид из 305 аминокислот, и имеет длинную нетранслируемую область из 3 простых элементов, содержащую повторяющийся элемент B2. Предсказанный белок Nanog содержит гомеобоксный домен, который наиболее похож на домены семейства генов Nk2 (см. 606727). Человеческий белок Nanog (FLJ12581) на 52% идентичен мышиному белку по общей аминокислотной структуре и на 85% идентичен по гомеодомену. Как человеческий, так и мышиный Nanog содержат богатые trp повторы, в которых trp-x-x-x повторяется 8 и 10 раз соответственно. Человеческий Nanog содержит повторяющийся элемент Alu в 3-простой непереведенной области. Поиск в базе данных EST выявил клоны, соответствующие человеческому Nanog, в библиотеках клеток тератокарциномы человека NT2, опухолей половых клеток и яичек, костного мозга и других опухолей. В библиотеках из нормальных соматических тканей не было обнаружено клонов EST.

Независимо друг от друга, Chambers et al. (2003) применили клонирование экспрессии в ES-клетках мыши для выделения детерминанты самообновления и получили кДНК, кодирующую Nanog. Путем поиска в базах данных последовательностей они идентифицировали ортологи Nanog у человека и крысы. Человеческий белок NANOG содержит 305 аминокислот.

Кларк и др. (2004) получили полноразмерную кДНК, кодирующую NANOG, путем ПЦР библиотек кДНК яичек человека и эмбриональных стволовых клеток. Нозерн-блоттинг-анализ тканей человека выявил слабую экспрессию транскрипта длиной 2,2 т.п.н. только в яичке взрослого человека. ОТ-ПЦР выявила экспрессию NANOG в яичках взрослого человека и яичниках взрослого и плода, но не в яичках мужчин с синдромом только клеток Сертоли (см. 400042). ПЦР в реальном времени выявила значительно более высокую экспрессию NANOG в семиномах по сравнению с нормальным яичком. NANOG экспрессировался недифференцированными культивируемыми эмбриональными стволовыми клетками человека, и экспрессия снижалась по мере прогрессирования дифференцировки.

Харт и др. (2004) идентифицировали 3 варианта сплайсинга мышиного Nanog. Самый длинный вариант кодирует белок из 305 аминокислот, а оба более коротких варианта кодируют белок из 279 аминокислот. ОТ-ПЦР выявила экспрессию Nanog в недифференцированных ES-клетках мыши и клетках эмбриональной карциномы. У предимплантационного эмбриона экспрессия была обнаружена в моруле и бластоцистах. Экспрессия присутствовала после имплантации, но была снижена после 8,5 эмбрионального дня. Низкие уровни Nanog были обнаружены во многих тканях взрослых мышей. Гибридизация In situ показала, что Nanog локализован во внутренней клеточной массе бластоцист мыши. Экспрессия снижалась по мере того, как клетки эпибласта входили в примитивную полосу и претерпевали переход от эпителия к мезенхиме. После поздней стадии распускания почек экспрессия Nanog ослабевала, и к 8-му дню ее нельзя было обнаружить. В развивающихся половых железах экспрессия Nanog была обнаружена на 11,5-й эмбриональный день.

Mitsui et al. (2003) показали, что ICM мыши с дефицитом Nanog не смогла генерировать эпибласт и продуцировала только париетальные клетки, подобные энтодерме. Мышиные ЭС-клетки с дефицитом Nanog теряли плюрипотентность и дифференцировались во внеэмбриональную линию энтодермы. Эти данные продемонстрировали, что Nanog является критическим фактором, лежащим в основе плюрипотентности как ICM, так и ES клеток.

Чемберс и др. (2003) определили, что Nanog направляет размножение недифференцированных ES-клеток. мРНК Nanog присутствовала в плюрипотентных клеточных линиях мыши и человека и отсутствовала в дифференцированных клетках. У предимплантационных эмбрионов Nanog был ограничен клетками-основателями, из которых могли быть получены ES-клетки. Было обнаружено, что эндогенный Nanog действует параллельно со стимуляцией цитокинами Stat3, стимулируя самообновление ES-клеток. Повышенная экспрессия Nanog в трансгенных конструкциях была достаточной для клональной экспансии ES-клеток, минуя Stat3 и поддерживая уровни Oct4 (164177). Цитокиновая зависимость, мультилинейная дифференцировка и способность к колонизации эмбрионов были полностью восстановлены после удаления трансгена. Эти результаты установили центральную роль Nanog в иерархии факторов транскрипции, определяющих идентичность ES-клеток.

Сильва и др. (2006) сообщили, что при слияниях между ES-клетками и нервными стволовыми клетками (NS) повышенные уровни Nanog стимулировали активацию плюрипотентных генов из генома соматических клеток и обеспечивали до 200-кратное увеличение восстановления гибридных колоний, все из которых демонстрировали характеристики ES-клеток. Nanog также улучшал выход гибридов, когда тимоциты или фибробласты сливались с клетками ES; однако было получено меньше колоний, чем при слиянии клеток ES x NS, что согласуется с иерархической восприимчивостью к перепрограммированию среди типов соматических клеток. Примечательно, что при слиянии клеток NS x ES повышенный уровень Nanog позволил первичным гибридам развиться в колонии клеток ES с частотой, идентичной гомотипическим продуктам слияния ES x ES. Это означало, что у гибридов увеличения Nanog было достаточно для того, чтобы эпигеном NS-клеток полностью восстановился до состояния плюрипотентности. Сильва и др. (2006) пришли к выводу, что Nanog может управлять механизмами ES-клеток для установления плюрипотентности с эффективностью до 100% в зависимости от статуса дифференцировки соматической клетки.

Wang et al. (2006) исследовали белковую сеть, в рамках которой Nanog функционирует в клетках ES мыши. Используя аффинную очистку Nanog в нативных условиях с последующей масс-спектрометрией, Wang et al. (2006) идентифицировали физически ассоциированные белки. Итеративным способом они также определили партнеров нескольких белков, ассоциированных с Nanog (включая Oct4), подтвердили функциональную значимость выбранных недавно идентифицированных компонентов и построили сеть взаимодействия белков. Сеть сильно обогащена ядерными факторами, которые индивидуально критичны для поддержания состояния ES-клеток и корегулируются при дифференцировке. Сеть связана с несколькими корепрессорными путями и состоит из многочисленных белков, кодирующие гены которых являются предполагаемыми прямыми мишенями транскрипции ее членов. Ван и др. (2006) пришли к выводу, что эта плотная белковая сеть, по-видимому, функционирует как клеточный модуль, отвечающий за плюрипотентность.

Перейра и др. (2006) показали, что Tcf3 (604652) ограничивает стационарные уровни мРНК Nanog, белка и промоторной активности в самообновляющихся ES-клетках мыши. Иммунопреципитация хроматина и репортерный анализ промотора показали, что Tcf3 связывается с промоторной регуляторной областью гена Nanog и подавляет его транскрипционную активность. Отсутствие Tcf3 задерживало дифференцировку ES-клеток in vitro, позволяя повышенным уровням Nanog сохраняться в течение 5 дней формирования эмбриоидного тела. Перейра и др. (2006) пришли к выводу, что TCF3-опосредованный контроль экспрессии NANOG позволяет ES-клеткам сбалансировать создание клеток, связанных с происхождением, и недифференцированных клеток

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS) могут быть получены из фибробластов мыши путем опосредованного ретровирусом введения 4 факторов транскрипции и последующего отбора на экспрессию Fbx15 (609093) (Takahashi and Yamanaka, 2006). Эти iPS-клетки, далее называемые iPS-клетками Fbx15, сходны с эмбриональными стволовыми клетками (ES) по морфологии, пролиферации и образованию тератомы; однако они отличаются в отношении экспрессии генов и паттернов метилирования ДНК и не способны продуцировать взрослые химеры. Okita et al. (2007) показали, что отбор на экспрессию Nanog приводит к получению iPS-клеток, компетентных к зародышевой линии, с повышенной экспрессией генов, подобных ES-клеткам, и паттернами метилирования ДНК по сравнению с iPS-клетками Fbx15. 4 трансгена, Oct3/4 (164177), Sox2 (184429), c-Myc (190080) и Klf4 (602253), были сильно подавлены в клетках Nanog iPS.

Верниг и др. (2007) независимо продемонстрировали, что транскрипционные факторы Oct4, Sox2, c-Myc и Klf4 могут индуцировать эпигенетическое перепрограммирование соматического генома в эмбриональное плюрипотентное состояние. В отличие от отбора на активацию Fbx15 (Takahashi and Yamanaka, 2006), фибробласты, которые реактивировали эндогенные локусы Oct4 (Oct4-neo) или Nanog (Nanog-neo), росли независимо от питающих клеток, экспрессировали нормальные уровни РНК и белка Oct4, Nanog и Sox2, были эпигенетически идентичны клеткам ES по соответствовали ряду критериев и смогли генерировать жизнеспособные химеры, вносить вклад в зародышевую линию и генерировать жизнеспособные эмбрионы на поздних сроках беременности после инъекции в тетраплоидные бластоцисты. Трансдукция 4 факторов генерировала значительно больше клеток с лекарственной устойчивостью из Nanog-neo, чем из фибробластов Oct4-neo, но более высокая доля отобранных Oct4 клеток обладала всеми характеристиками плюрипотентных ES-клеток, что позволяет предположить, что активация Nanog является менее строгим критерием плюрипотентности.

Ю и др. (2007) показали, что 4 фактора, OCT4 (164177), SOX2 (184429), NANOG и LIN28 (611043), достаточны для перепрограммирования соматических клеток человека в плюрипотентные стволовые клетки, которые проявляют основные характеристики эмбриональных стволовых клеток. Эти индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека имеют нормальные кариотипы, экспрессируют активность теломеразы, экспрессируют маркеры клеточной поверхности и гены, которые характеризуют ЭС-клетки человека, и сохраняют потенциал развития для дифференцировки в продвинутые производные всех 3 первичных зародышевых листков.

Мураками и др. (2016) исследовали роль Nanog в унипотентных примордиальных половых клетках мыши на модели in vitro, в которой наивные плюрипотентные ES-клетки, культивируемые в базовом факторе роста фибробластов (bFGF) и активине А, развиваются как эпибластоподобные клетки (EpiLCs) и приобретают способность к PGC-подобной судьбе. Следовательно, костный морфогенетический белок-4 (BMP4; 112262), или эктопическая экспрессия ключевых факторов транскрипции зародышевой линии Prdm1 (603423), Prdm14 (611781) и Tfap2c (601602), непосредственно индуцирует PGC-подобные клетки (PGCLC) в EPILC, но не в ES-клетках. Мураками и др. (2016) неожиданно обнаружили, что только Nanog может индуцировать PGCLC в EPILC независимо от BMP4, и предположили, что после распада сети плюрипотентности наивных ES-клеток во время создания EPILC эпигеном сбрасывается для определения судьбы клетки.

Mitsui et al. (2003) заявили, что человеческий ген Nanog соответствует хромосоме 12 в области, демонстрирующей гомологию синтении с мышиной хромосомой 6, где расположен мышиный ген Nanog.

С помощью анализа геномной последовательности Clark et al. (2004) сопоставили ген NANOG с хромосомой 12p13. Харт и др. (2004) идентифицировали дубликат гена NANOG, который они назвали NANOG2 (NANOGP1), примерно на 100 кб выше по течению от гена NANOG. Эти 2 гена находятся в конфигурации "голова к хвосту". Харт и др. (2004) также идентифицировали псевдогены NANOG на хромосомах 15q, 7p, 14q, 2q, Xp и Xq.